領(lǐng)學(xué)術(shù)科研之先，創(chuàng)食品科技之新
—— 中國(guó)食品雜志社
為實(shí)現(xiàn)硫酸軟骨素酶AC(chondroitinase AC，ChonAC)在大腸桿菌中高效表達(dá)，通過(guò)PCR方法從肝素黃桿菌(Pedobacter heparinus)中擴(kuò)增得到ChonAC基因cslA，采用融合蛋白技術(shù)構(gòu)建麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-bindingprotein，MBP)與ChonAC的融合表達(dá)載體(MBP-ChonAC)，并在低溫(15℃)條件下實(shí)現(xiàn)MBP-ChonAC的可溶活性表達(dá)，通過(guò)MBPTrap HP可實(shí)現(xiàn)一步純化，使純度可達(dá)95%以上，酶比活力可達(dá)94.1IU/mg融合蛋白(即相當(dāng)于143.8IU/mgChonAC蛋白當(dāng)量)。對(duì)MBP-ChonAC的酶學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其最佳催化pH值為7.5～8.0，最佳Ca2+濃度為20mmol/L，最適NaCl濃度為50mmol/L，最佳作用溫度為20～35℃。MBP-ChonAC具有較好的熱穩(wěn)定性，在30℃時(shí)其半衰期可達(dá)8.3h。同時(shí)對(duì)其以硫酸軟骨素A為底物的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，MBP-ChonAC相比ChonAC其Km稍有增大而催化常數(shù)kcat稍有降低，但是差別不大，表明MBP的融合沒有對(duì)ChonAC的催化能力造成影響。通過(guò)宿主優(yōu)化、誘導(dǎo)濃度優(yōu)化及培養(yǎng)基優(yōu)化進(jìn)一步提高了MBP-ChonAC的表達(dá)量，其搖瓶培養(yǎng)酶活力就可達(dá)10800.5IU/L。
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