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基于內(nèi)參的大腸埃希氏菌O157∶H7實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立
來源:食品科學(xué)網(wǎng) 閱讀量: 269 發(fā)表時間: 2017-06-07
作者: 王建昌,王金鳳,段永生,李 靜,陳志敏,陳瑞春
關(guān)鍵詞: 大腸埃希氏菌O157∶H7;rfbE;Flic;實時熒光定量PCR;內(nèi)參
摘要:

針對大腸埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列,設(shè)計特異性引物和探針,優(yōu)化反應(yīng)體系,并加入內(nèi)參(internal amplification control,IAC),建立能夠?qū)崟r監(jiān)控反應(yīng)過程的熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymeasechain reaction,PCR)檢測方法。結(jié)果表明,該方法對E. coli O157∶H7基因組DNA的最低檢測限為1 pg/μL;對含有靶基因質(zhì)粒的最低檢測限為103 copies/μL;對細(xì)菌的最低檢測限為5×103 CFM/mL;Ct值與模板拷貝數(shù)均呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999)。人工污染實驗結(jié)果表明,在初始菌量為7 CFM/25 g時,采用水洗加試劑盒法提取DNA,E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可檢出;而采用水煮法提取DNA,則在增菌10 h后方可檢出。建立的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR方法,既能有效檢測食品中O157∶H7,又能實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程,有效防止“假陰性”的發(fā)生。

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