領(lǐng)學(xué)術(shù)科研之先，創(chuàng)食品科技之新
—— 中國(guó)食品雜志社
針對(duì)目前國(guó)產(chǎn)食品級(jí)亮氨酸氨肽酶的工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)量不高的現(xiàn)狀，將米曲霉、黑曲霉和醬油曲霉的5 個(gè)亮氨酸氨肽酶基因（lapA、lap1O、lap2、lap1S、lap1N）在低蛋白背景的無(wú)孢黑曲霉HL-1中進(jìn)行重組表達(dá)，通過(guò)信號(hào)肽替換對(duì)其編碼區(qū)進(jìn)行改造，利用雜合啟動(dòng)子PnaII及營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記pyrG構(gòu)建表達(dá)載體，并基于規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9工具設(shè)計(jì)亮氨酸氨肽酶的基因組定點(diǎn)整合策略，獲得高活力的亮氨酸氨肽酶表達(dá)菌株，重組菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到11 701.2 U/mL，比未利用CRISPR工具的LapA-T重組表達(dá)菌株的酶活力（2 476.0 U/mL）提高了約3.7 倍。此外，通過(guò)融合6×His標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了重組亮氨酸氨肽酶LapA的純化，并對(duì)其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究：蛋白質(zhì)大小約為35.0 kDa，重組亮氨酸氨肽酶LapA最適pH值為8.5，最適溫度為65 ℃。綜上所述，本研究基于CRISPR策略成功實(shí)現(xiàn)了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重組表達(dá)。
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