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—— 中國食品雜志社
目的：構(gòu)建抗呋喃它酮代謝物(AMOZ)的衍生物噬菌體單鏈抗體庫。方法：從分泌抗AMOZ 的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系(BC3-E8)中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計通用簡并引物，PCR 擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)基因(VH)和輕鏈可變區(qū)基因(VL)。經(jīng)重疊延伸PCR (SOE-PCR)，將VH 和VL 基因用編碼(G1y4Ser)3 的linker隨機(jī)拼接成單鏈抗體(scFv)基因，然后將其克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E 中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) TG1 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)輔助噬菌體M13K07 超感染，建立噬菌體單鏈抗體庫。隨機(jī)挑取10 個陽性克隆，經(jīng)PCR 和雙酶切鑒定，并測序。登陸DNAMAN 軟件對序列進(jìn)行分析、比對。結(jié)果：成功擴(kuò)增VH、VL 及scFv 基因，并得到庫容為1.2 × 106 的噬菌體抗體庫，噬菌體的滴度為2.0 × 1010PFU，PCR 鑒定及雙酶切鑒定文庫重組率較高，軟件對序列比對結(jié)果顯示，scFv 基因全長序列之間差異為8.38%，VH 序列差異為3.68%，VL 序列差異為14.34%，且序列差異多集中在CDR 抗原結(jié)合區(qū)域?qū)?yīng)的核酸序列上。結(jié)論：已構(gòu)建抗呋喃它酮代謝物的衍生物噬菌體單鏈抗體庫，為進(jìn)一步富集篩選并表達(dá)抗AMOZ 的衍生物的單鏈抗體提供參考。
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