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—— 中國食品雜志社
構(gòu)建大容量核糖體展示抗克倫特羅單鏈抗體(single-chain fragment variant，scFv)文庫，為進一步篩選抗體奠定基礎(chǔ)。用克倫特羅人工抗原免疫小鼠，分離其脾細胞；Trizol法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR及重疊延伸PCR法構(gòu)建核糖體展示scFv 文庫。再通過PCR和重疊延伸PCR在scFv文庫序列5＇端添加T7啟動子、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、核糖體結(jié)合位點，3＇端添加間隔區(qū)序列(T20-V109)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)建核糖體展示抗克倫特羅scFv文庫。核糖體展示scFv文庫與Easy T3載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選，挑取5個陽性克隆雙酶切和測序鑒定。結(jié)果表明：用于建庫材料的免疫小鼠效價為1:128000；成功擴增重鏈可變區(qū)基因大約為360bp和輕鏈可變區(qū)基因大約為330pb；核糖體展示scFv文庫基因大約1200bp；庫容量達1.75×1013；陽性重組質(zhì)粒均含有1200bp插入片段；利用IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫對單鏈抗體可變區(qū)進行序列分析結(jié)果表明，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因均由胚系基因重排得到，且與鼠源胚系基因同源率都達84%以上；氨基酸序列比對結(jié)果表明，重鏈可變區(qū)氨基酸序列同源率為37.82%，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列同源率為39.09%。其中多樣性主要發(fā)生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功構(gòu)建了大容量抗克倫特羅單鏈抗體核糖體展示文庫。
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