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擬穴青蟹新型過敏原肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白的純化、鑒定及分子克隆
來源:食品科學(xué)網(wǎng) 閱讀量: 130 發(fā)表時間: 2017-06-07
作者: 毛海燕,蔡 娜,陳亨莉,曹敏杰,蔡秋鳳,劉光明
關(guān)鍵詞: 擬穴青蟹;新型過敏原;肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白;純化;質(zhì)譜分析;分子克隆;生物信息學(xué)分析
摘要:

為進一步認(rèn)識蟹類的過敏原,采用免疫印跡方法,分析發(fā)現(xiàn)甲殼類過敏患者血清能與擬穴青蟹肌漿蛋白中分子質(zhì)量約為21 kD的蛋白質(zhì)產(chǎn)生特異的IgE結(jié)合反應(yīng),結(jié)果顯示該蛋白可能是蟹類新型過敏原。通過硫酸銨鹽析、陰離子交換和凝膠過濾柱層析等方法對21 kD-蛋白進行分離純化,采用Western blotting和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)確認(rèn)純化的21 kD-蛋白為肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein,SCP)。采用SMART-RACE(SwitchingMechanism At RNA Termini-Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法獲得SCP的cDNA序列,該序列全長986 bp,開放閱讀框為579 bp,編碼193 個氨基酸,其理論分子質(zhì)量21.94 kD,等電點4.44。擬穴青蟹SCP與甲殼類動物SCP具有較高的同源性,與昆蟲SCP的同源性較差;三級結(jié)構(gòu)模擬分析顯示,SCP含有5 個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū),即EF-手型結(jié)構(gòu)區(qū),并在其中兩個手型結(jié)構(gòu)區(qū)形成2 個鈣離子結(jié)合位點;進一步預(yù)測得到SCP的4 個線性抗原表位和3 個構(gòu)象性抗原表位。

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