領(lǐng)學(xué)術(shù)科研之先，創(chuàng)食品科技之新
—— 中國食品雜志社
以‘寧杞1號’枸杞果實(shí)為材料，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)，克隆出枸杞木糖異構(gòu)酶基因（Lycium barbarum Linn. xylose isomerase，LbxylA）的全長，開放閱讀框?yàn)? 446 bp，編碼481 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53.54 kDa，理論等電點(diǎn)5.37；對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LbxylA與煙草和馬鈴薯的木糖異構(gòu)酶基因序列相似性較高，達(dá)到95%；構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX4T-1-LbxylA，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta（DE3）中進(jìn)行原核表達(dá)，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-Dthiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選出重組蛋白的適宜表達(dá)條件為：在18 ℃條件下100 μmol/L IPTG誘導(dǎo)10 h蛋白量最大，該蛋白為融合表達(dá)的且部分可溶；進(jìn)一步純化該蛋白并將獲到的LbxylA融合蛋白為抗原，以日本大耳兔免疫制備LbxylA多克隆抗體，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定法，測定抗體血清的效價(jià)高于1∶81 000；隨著果實(shí)的發(fā)育，果實(shí)中LbxylA的相對表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，且在開花后9 d果實(shí)中LbxylA表達(dá)豐度最高；利用Western blot檢測到LbxylA蛋白的變化與LbxylA相對表達(dá)量基本一致，但在開花后9 d果實(shí)中蛋白表達(dá)量低于開花后15 d，隨后逐漸降低，果實(shí)成熟時(shí)兩者的表達(dá)量到達(dá)最低。這表明枸杞果實(shí)發(fā)育前期LbxylA蛋白由于翻譯后加工可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)滯后于基因，其結(jié)果有助于進(jìn)一步研究LbxylA功能及其對果實(shí)糖積累的作用。
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