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—— 中國(guó)食品雜志社
目的:構(gòu)建小牛凝乳酶原乳酸克魯維酵母分泌型表達(dá)載體,表達(dá)重組凝乳酶原。方法:通過PCR獲得小牛凝乳酶原cDNA片段,將目的基因插入酵母表達(dá)載體pKLAC1α結(jié)合因子分泌信號(hào)下游,得到重組載體pKLAC1-prochymosin。SacⅡ線性化后氯化鋰轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799,用含5mmol/L乙酰胺的YCB固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化酵母菌,PCR鑒定目的基因,利用特異性引物篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶表達(dá),取上清TCA沉淀后做TricineSDS-PAGE分析并檢測(cè)凝乳酶的活力,通過檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子產(chǎn)凝乳酶的活力考察其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果:經(jīng)測(cè)序及PCR證實(shí),凝乳酶原cDNA準(zhǔn)確插入酵母表達(dá)載體pKLAC1中,轉(zhuǎn)化后重組載體通過同源重組整合進(jìn)入酵母基因組中。TricineSDS-PAGE分析證明凝乳酶的分子量約為36kD,酸處理后測(cè)得培養(yǎng)基中凝乳酶的酶活為83SU/ml,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性好。結(jié)論:成功構(gòu)建出酵母表達(dá)載體pKLAC1-prochymosin,在培養(yǎng)基中獲得分泌的重組凝乳酶原,經(jīng)過酸處理后凝乳酶原轉(zhuǎn)化為有活性的凝乳酶。
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