領(lǐng)學(xué)術(shù)科研之先，創(chuàng)食品科技之新
—— 中國食品雜志社
選取天冬氨酸激酶抑制劑賴氨酸（Lys）的結(jié)合位點(diǎn)蘇氨酸（Thr）379和丙氨酸（Ala）380、底物天冬氨酸（Asp）的結(jié)合位點(diǎn)Thr65、既是底物也是ATP結(jié)合位點(diǎn)的催化活性中心Asp173，對4 個關(guān)鍵殘基位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。采用高通量篩選方法成功構(gòu)建突變體T379N/A380C/T65I/D173G，與野生型（wild type，WT）相比，酶活力提高到75.83 倍。動力學(xué)與酶學(xué)性質(zhì)表征顯示：相比于WT，Km值由4.11 mmol/L降低至1.34 mmol/L，表明與底物親和力增強(qiáng)；n值由1.71減小到1.07，正協(xié)同性降低。突變體T379N/A380C/T65I/D173G最適反應(yīng)溫度由WT的25 ℃提高到30 ℃，最適pH值與WT相同均為8.0，半衰期由WT的4.24 h縮短至3.23 h。突變體在0.2～10 mmol/L抑制劑濃度下，抑制作用整體減弱，尤其在Lys和Lys＋Thr作用下明顯激活。通過無縫克隆技術(shù)電轉(zhuǎn)入北京棒桿菌構(gòu)建工程菌，發(fā)酵測得Lys產(chǎn)量相比WT提高83.05%，Thr提高29.36%，甲硫氨酸（Met）提高30.77%，為優(yōu)化天冬氨酸激酶代謝途徑和構(gòu)建高產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸菌株提供參考。
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