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—— 中國食品雜志社
根據(jù)沙門氏菌的侵染上皮細胞表面蛋白基因(invA)、單增李斯特菌的侵入關聯(lián)蛋白基因(iap)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)和副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素基因(tdh)分別設計4對特異性引物，并以細菌16S rRNA基因的部分保守序列為內標，通過對退火溫度、引物濃度等反應參數(shù)的調整和優(yōu)化，建立的多重PCR方法為10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、dNTP 200μmol/L、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶2.5U，引物濃度分別為16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L，加無菌水至總體積為20μL；反應條件：94℃預變性4min、94℃變性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min，反應共進行30個循環(huán)。為檢驗該方法的可行性，進一步對人工接種上述4種病原菌的南美白對蝦進行多重PCR檢測。結果表明：對污染樣品直接提取DNA和預增菌后提取DNA再進行多重PCR檢測，均能有效擴增出各個目的片段；但預增菌處理后可使檢測限明顯降低，進而大大提高檢測的靈敏度。本多重PCR方法可作為食品包括水產品中病原微生物的快速、靈敏和高效的檢測方法。
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